Nature Protocols：半月构建造血-心脏双潜能类器官

在体外同时“复刻”跳动的心脏与奔涌的血液，一直是发育生物学与再生医学的夙愿。如今，这一愿景被浓缩进直径仅几毫米的“血液-心脏类器官”（BG-HFO）中。

Miriana Dardano等人以人类多能干细胞为起点，通过一步嵌入三色凝胶、精准调控WNT信号并辅以定制细胞因子组合，在14天内即可诱导出兼具心肌、内皮与多波造血谱系的3D共生模型。

此外，还推出一套“零高端设备门槛”的2.5天整体、透明化与成像流程，让普通激光显微镜也能对4 mm的复杂类器官进行细胞级全景解析。

该方案不仅填补了造血-心脏协同发育的体外研究空白，也为疾病建模、药物毒理和个体化医疗提供了可扩展、可重复的新舞台。

文章介绍

题目：生成可产生人血液的人心脏类器官及高级成像的样品制备

英文题目：Production of human blood-generating heart-forming organoids and sample preparation for advanced imaging

期刊：nature protocols

影响因子：16.0

PMID：41168363

发表日期：2025年10月

Part.01

研究背景

类器官已经被开发用于模拟并研究源自三胚层的多种组织器官，同时洞察人类胚胎发育。该研究团队前期已经构建了一种高度结构化的人多能干细胞（hPSC）模型——“心脏类器官（HFO）”，可重现心脏、血管及前肠的协同早期发育。

然而，该模型尚未涵盖心血管与造血系统在解剖层面的共同发生：在人胚第三周，两侧心原区融合成搏动心管，同期背主动脉亦融合并与心管相连；第四周，主动脉腔内启动确定性造血，而胚外已先有原始造血支持胚胎。这些过程提示心-血管-造血谱系源自同一中胚层前体，仍需补全这一关键发育环节。

为在体外复现这段发育窗口，本研究在已有心血管谱系的心脏类器官基础上加入造血诱导，得到造血型心脏类器官（BG-HFO）。其仍保持三层：内核（IC）、心肌层（ML）和外层（OL）。IC为内皮与间充质；ML为腔样心肌，外包OL。OL含心肌、横隔样及内皮细胞，其中“生血内皮”可产生造血祖细胞（HPC），进而生成巨核/红系、髓系及T细胞祖细胞前体，提示原发与定向造血并存。

Part.02

研究思路

·       hPSC的培养（步骤1-13）

·       hPSC生成BG-HFO（步骤14-41）

·       BG-HFO的监测和表征（步骤42-58）

Part.03

实验设计

首先在d-4以96孔格式从每孔单层培养中接种5000个hPSC（步骤14-16）。在d-2，得到的聚集体单独嵌入到基质胶的液滴中（步骤17-24）；从d0到d1，添加CHIR 24 h激活WNT途径（步骤25-31）。随后，从d3到d5，补充IWP2处理48h抑制WNT途径（步骤32-34）。在分化的d5和d7，改变培养基（步骤35-40）（图1）。

为了产生BG-HFO，从d-2开始，在每个时间点都进一步添加不同的血液内皮驱动生长因子和细胞因子混合物。到D10，BG-HFO在生长（步骤41）；选择适当分化的类器官（步骤42-43），并且成功的类器官可以进一步保存（步骤44-48）或直接进行整体免疫荧光染色（步骤49-50），以及改进的透明方法（步骤51）。

图1 hPSC分化形成BG-HFO的方案示意图。

与其他方法的比较

BG-HFO在体外概括了早期人的心脏和血液内皮细胞，包括心脏、内皮和造血的共同发育，同时存在原始的和确定的造血，而且还含有原始和最终造血细胞的红系衍生体，髓系细胞，和具有淋巴潜能的细胞。

其他模型缺乏伴随和促进体内造血生态位发育的结构化组织，即主动脉下间充质（MES）和心脏胶原。BG-HFO的独特之处在于它们能够模拟造血系统的共同发展，包括原始和最终的造血波以及与解剖相关的心脏和血管组织。

预期结果

该研究方案给出从hPSC一步生成多组织BG-HFO的完整流程，是在原HFO方案的基础上加入同步造血诱导的升级版。成功率70-80%，视细胞系而异，HHSC_Iso4_ADCF_SeV-iPS最低约35%。

可直接用NKX2.5-EGFP报告系观察结构：心肌层亮绿，内核暗，外层部分亮。若无转基因，只需做NKX2.5、α-actinin或cTnT等心肌标志的整体免疫染色；MIXL1-GFP或HHSC_Iso4-iPS2等细胞系也能用（图2）。

图2 通过转基因信号或抗体染色和BG-HFO形成效率鉴定BG-HFO模式。

整体免疫染色和MSBB透明化，可把大体积BG-HFO/HFO一次看清3D格局，BG-HFO的EC分布在内核+外层，HFO主要在内核。若用PEGASOS透明，NKX2.5-EGFP天然荧光会被削弱，难与组织自发荧光区分；改用红色/远红光报告基因即可避免（图3-4）。

图3 HES3 NKX2.5-EGFP来源的BG-HFO/HFO在MSBB透明后的内皮和心脏模式。

图4 在PEGASOS透明后，HES3 NKX2.5-EGFP来源的BG-HFO中的内皮和心脏图案。

免疫荧光染色和透明显示特征细胞类型的平行存在及其在BG-HFO中的定位。IC和OL中存在CD31+/CD144+的内皮细胞（EC），ML和OL中存在NKX2.5+的心肌细胞，IC和OL中存在Vimentin+的间充质细胞，OL中存在CD45+的造血细胞（HC），未染色区域表示BG-HFO中的额外细胞谱系，包括PE/ST样细胞、分化的造血细胞和前肠后内胚层（PFE；胎肝样组织）。

流式细胞术对BG-HFO的细胞类型组成进行定量评估。约有12-20%的NKX2.5eGFP+和cTnT+的心肌细胞，20-25%的CD31+和CD144+的内皮细胞，7-10%的CD34+的血液内皮细胞，10-20%的CD43+的HC和4-6%的CD45+的HC（图5）。

图5 BG-HFO的结构和细胞组成。

应用

BG-HFO结构规整且重复性好，是体外研究心脏与造血协同发育的利器，可绕过人类胚胎伦理限制。scRNA-seq已揭示BG-HFO中的MES产生的配体在动脉内皮细胞中上调细胞迁移、血管生成和血管萌发的过程，类似于主动脉下MES对天然胚胎背部主动脉发育的支持作用。

BG-HFO模型可用于高级扰动研究，例如遗传修饰、致畸治疗和药物化合物暴露，对预测毒理学研究和药物开发有价值。患者来源的人诱导多能干细胞（hIPSC）可以用于建模和研究相应器官和组织的胚胎/先天性缺陷。

此外，通过激光显微镜对BG-HFO进行整体免疫荧光染色和透明以研究其形态的方法，适用于由多种细胞类型（不同物理性质）组成的大组织和类器官（直径达4 mm），如BG-HFO、HFO等复杂类器官模型。

局限性

BG-HFO模型的局限性包括在胚胎发生中明显缺乏外胚层和内胚层，组织不成熟。尽管基因表达模式和功能分析显示该模型中既存在原始的造血波又存在明确的造血波，但流式细胞术在难以区分这些波。潜在的原因包括缺乏专有的谱系标记，以及这些波在我们的器官系统中同时发生。

BG-HFO中发生了哪一波明确的造血波还有待更好的确定；最终的瞬时波和造血干细胞依赖波都能产生具有红系和淋巴系潜能的HPC，需要未来的体内植入研究才能定性。

另一个限制是BG-HFO中，造血室和心脏室同时发育，比体内提前一周。最后，BG-HFO中未检测到体内存在的外胚层卵黄囊。

实验步骤

hPSC的培养

单层培养的启动（10 min，加2-4天的维持）

1. 在37℃的预置水浴中，通过手轻轻摇动，从单层细胞库（每瓶冷冻3×10^6个细胞）中解冻冷冻的hPSC。当小瓶开始解冻时，立即将内容物转移到15毫升的锥形管中，其中包含9毫升的E8或DMEM/F-12培养液。

关键：快速工作，防止细胞损坏。

2. 将装有细胞的圆锥管在4℃下300 g离心3分钟。

3. 用真空泵取出上清液，将细胞颗粒重新悬浮在2 mL E8+10 μM Y27632中。

4. 取一个准备好的Geltrex涂层T25烧瓶，吸入用于涂层的DMEM/F-12，并加入3 mL预热的E8+10 μM Y27632。

5. 将2 mL的细胞悬浮液从锥形管转移到T25烧瓶中，将烧瓶放入培养箱中，确保细胞均匀分布（通过向多个方向轻轻移动烧瓶）。

6. 2天后更换培养液，然后每天抽出培养液，加入5 mL新鲜预热的E8。当细胞达到90%-100%融合时（通常在接种后2-3d），继续下一步。

hPSC单层培养传代（30 min，加3-4天的维持）

7. 用抽吸法从汇合的T25烧瓶中取出培养液，用5 mL无菌PBS冲洗细胞，然后抽吸。加入1 mL Accuase酶，将烧瓶放入培养箱中3分钟。

关键：较长时间的酶消化可能影响细胞质量。

8. 在烧瓶中加入5 mL DMEM/F-12，停止Accuase的酶作用，用血清吸管上下分离细胞，将细胞悬液转移到15 mL的锥形管中。在4℃下300 g离心3分钟。

9. 抽吸上清液，将细胞颗粒重新悬浮在1 mL E8+10 μM Y27632中。

10. 用台盼蓝染色进行细胞计数，用标准方法用血细胞计数器计数。

11. 为了在培养的3-4天内达到融合，将HES3 NKX2.5-EGFP和HES3 MIXL1-GFP细胞系和IPSC HHSC_Iso4_ADCF_SeV-iPS2细胞系的约0.5×10^6个细胞和0.6×10^6个细胞接种在准备好的含有5 mL E8+10 μM Y27632的Geltrex包被的T25瓶中，将其放入培养箱中，并按照步骤5的描述通过移动烧瓶来确保细胞均匀分布。

关键：需要确定其他HPS细胞系的最佳接种密度。

12. 2天后更换培养液，然后每天换掉旧的培养液，加入5 mL新鲜的E8。

13. 当hPSC在T25中达到95%-100%融合时，通过重复步骤7-12再次传代。

关键：建议在开始BG-HFO分化之前，从单层来源的冰冻材料中接种hPSC至少传代两次。在单层培养中不超过8代，并定期评估细胞的多能性。

hPSC生成BG-HFO

d-4：细胞接种和hPSC聚集体的形成（45 min）

关键：在这里描述了在96孔板格式中并行产生48个单独的BG-HFO的策略和所需的时间。

14. 如步骤7-10所述，将细胞从T25瓶中分离出来。计数后，将0.3×10^6个细胞重新悬浮在预先准备的6 mL E8培养基+10 μM Y27632中，最终细胞浓度为5000个/100 μL(细胞悬液)。

关键：在分化d−2天至第10天期间，HES3 NKX2.5-eGFP36细胞系（第7天起呈现正常心肌细胞模式）和HES3 MIXL1-GFP37细胞系（第2至第4天呈现正常中胚层模式）的BG-HFO形态变化可见。使用倒置荧光显微镜从培养板底部观察类器官时（类器官正视图），可清晰观察到该模式形成过程。

关键：计数需要保证准确，细胞数量对有效的BG-HFO分化至关重要。

关键：准备比48孔（48孔×100 μL）的实际所需更多的细胞悬浮液，以便于正确的移液（如步骤14中，建议准备6 mL细胞悬浮液，尽管只需要4.8 mL）。考虑接种比实验所需的最终类器官数量更多的孔（如多6-12孔），以确保在分化结束时有足够的成功形成BG-HFO，并相应地制备更多的细胞悬浮液。

关键：如有必要，可根据细胞系的不同调整细胞悬液。

15. 将细胞储备悬液以每孔100 μL的体积接种于U形超低附着96孔板的四行孔中（相当于每孔5000个细胞）。

16. 将培养板在4℃下以300 g的温度离心6 min，然后将培养板放入培养箱中；细胞现在位于每孔的底部，过夜将形成聚集体。

d−2：hPSC聚集体的基质包埋和BMP4的诱导（2 h）

关键：接种后2d，每个聚集体均嵌入基质胶液滴中。然后，通过添加BMP4启动分化（中胚层前启动）。

17. 解冻所需量的基质胶，需确保每个聚集体均嵌入20 μL的基质胶滴液中。从烘箱中取出无菌剪刀并使其冷却。

关键：正确的时机是成功分化的关键。聚集体的包埋必须在d−4的细胞接种后52 h开始。因此，要及时解冻基质和冷却剪刀。

关键：防止在室温下迅速引发的基质胶过早聚合，将基质胶等分放在冰上。当基质胶开始解冻（颜色从黄色变为粉色）时，将等分放入冰中。

关键：即使在冰上处理，部分基质胶在解冻时也会聚合。因此，应解冻过量的基质胶（比所需量多100 μL），以确保有足够的材料用于目标聚集体的包埋。

18. 在显微镜下，选择适当形成的hPSC聚集体（圆形、均匀、无灰尘，尺寸在550-650 μm范围内）。只有这些聚集体才会嵌入到基质胶中

19. 用20-200 μL移液管，将20 μL吸管放入一个空孔中（放在同一块板或新的96 U孔板中）。

20. 用无菌剪刀将2-20 μL移液管的尖端剪下2-3 mm，扩大开口，将移液管设置为3 μL。用尖端接触孔底，同时对准聚集体的位置（这样聚集体将位于切割尖端的孔内），然后松开移液管的推杆，吸出第一个聚集体。

21. 将聚集体浸入液滴中，并将吸管的柱塞按到第一个阻力点，将聚集体转移到基质胶液滴。

关键：建议只将吸管压到第一个阻力点，以避免在基质胶液滴中形成气泡。

关键：如果意外地拾取聚集体失败，并且只将培养基输送到基质胶液滴中，则可以使用同一液滴重复此步骤一次。如果再次嵌入失败（6 μL培养基已在基质胶液滴内），则丢弃该液滴并继续使用新液滴。否则，基质胶液滴将过于脆弱，导致分化不成功。

22. 对所有的聚集体重复步骤20-21，然后将板放入孵育箱中1小时，让基质胶固化。

关键：建议在开始时将聚集体逐个嵌入到基质胶液滴中。在更多的实践中，有可能首先吸管最多四个液滴，然后插入聚集体。

23. 在1 h的孵育时间内，准备由富含BMP4的E8组成的d−2培养液。

24. 孵育1h后，将吸管的柱塞缓慢按压到第一个阻力点，在每个嵌入的聚集体的顶部逐一加入100 μL培养基，以避免基质胶液滴的移动和气泡的形成。

关键：缓慢添加培养基，以避免移动/破坏基质胶液滴和聚集体。

从d0到d10：CHIR和IWP2诱导与血管内皮细胞驱动分化（每次更换介质1小时，共10天）

25. 在d0，基质胶包埋后48 h，CHIR介导的WNT通路激活开始。制备d0培养基，由富含CHIR、BMP4和bFGF的RB-培养基组成。

关键：CHIR是光敏的；当制备培养基和将其添加到类器官中时，在黑暗中进行。

关键：如有必要，可根据细胞系调整CHIR浓度。

26. 到d0时，聚集体将长大并显示平滑的边缘。小心地从孔中取出培养基，以避免损坏基质胶液滴和正在生长的类器官。因此，握住板时，请将类器官打开并倾斜45°。用P1000吸管，从孔中取出大部分培养基，将喷嘴指向远离基质胶液滴的位置，直到基质胶液滴从培养基中出现。

27. 使用p200移液器清除残留培养基：将移液器尖端对准孔底，在基质胶液滴周围左右轻柔移动的同时吸取培养基。重复此步骤直至孔内所有培养基被清除。

关键：为确保后续步骤中分子、生长因子和细胞因子的浓度准确，必须彻底清除所有培养基。

28. 如步骤24所述，在每孔中加入200 μL的d0培养基。

关键：注意添加d0培养基的时间。

29. 次日（d1），配制富含VEGF和bFGF的d1 RB-培养基。

30. 严格在d0（即步骤28记录的时间）后24小时（+最多0.5小时）内，按步骤26和27所述移除培养基。

关键：必须严格控制d0（步骤28记录时间）至d1的间隔为24小时（+最多30分钟），以确保分化正常。过长或过短的CHIR暴露时间均会损害分化效果。

31. 通过缓慢按压移液器活塞至首次阻力点，向每个类器官添加200 µL培养基。此步骤起可改用多通道移液器向培养板加注培养基。此时聚集体体积将进一步增大，边缘可能出现不规则形态。

32. 2天后（d3），配制富含IWP2、VEGF、bFGF、SCF、EPO、IL-6、IL-11和IGF-1的d3 RB-培养基。

33. 至d3时，聚集体将进一步增大并呈现不规则边缘；若使用HES3 MIXL1-GFP细胞系，可观察到MIXL1-GFP阳性的中胚内胚层环。按照步骤26和27的说明移除培养基。

34. 按照步骤31的说明，向每个类器官添加准备好的d3 RB-培养基。

35. 48小时后（d5，最多可延长3小时），配制富含VEGF、bFGF、SCF、EPO、IL-6、IL-11、IGF-1、TPO、FLT-3、IL-3、BMP4和SHH的d5 RB-培养基。

36. 至d5时，聚集体将进一步增大；若使用HES3 MIXL1-GFP细胞系，MIXL1-GFP阳性的中胚内胚层环将几乎完全褪色。按步骤26和27所述移除培养基。

关键：建议严格控制d3至d5期间的培养时间为48小时（最多延长3小时），避免IWP2长期暴露引发的负面效应。

37. 参照步骤31向每个类器官添加预制培养基。

38. 培养2天后（d7），配制富含步骤35所列分子的d7 RB+培养基。

39. 至d7时，聚集体将达到最大尺寸约2.5 mm，其边缘呈现不规则形态和松散组织；若使用HES3 NKX2.5-eGFP细胞系，可观察到NKX2.5-eGFP阳性的ML环。按步骤26和27所述移除培养基。

关键：自第7天起，换液时间点不再受限。

40. 按步骤31所述向每个类器官添加预制培养基。

41. 自第10天起，BG-HFO视为完全发育成熟。按步骤42-43筛选分化良好的类器官。随后可选择：执行步骤44-48，将BG-HFO培养至1个月以促进组织成熟或进行实验处理；直接使用BG-HFO进行后续分析（详见步骤49及后续操作）。

图6 BG-HFO的发育。

BG-HFO的监测和表征

选择适当分化的类器官并成像（1h）

42. 在分化结束且进行后续分析前，对BG-HFO进行明场摄影，若使用转基因系则需同时进行荧光摄影，以评估内细胞团/中胚层/外胚层形态，从而判断分化成功与否。BG-HFO直径可达2 mm，因此需使用5×物镜（或更低倍镜）。拍摄时可将类器官保留在96孔板及培养基中。为消除活体成像中的潜在背景噪声，可暂时用无钠PBS培养基替代原培养基。

43. 仅选择成功生成的BG-HFO进行后续分析（例如共聚焦显微镜、流式细胞术和单细胞RNA测序），或将其保留进行延长培养。呈现异常形态的类器官应予以弃用，因其可能未包含所有目标细胞类型。

关键：建议在对应塑料容器（锥形管/微量离心管/96孔平底板）盖子上标注所选类器官的标记物，以确保可追溯性。

图7 选择合适的分化BG-HFO。

扩增培养BG-HFO（培养基更换1小时，基质胶更新2小时）

44. 按照步骤38所述配制d7培养基。

45. 参照步骤26和27所述移除培养基。

46. 按照步骤31所述向每个类器官添加配制好的培养基。

47. 每3-4天重复更换培养基，持续时间可根据需求调整。

48. 每隔两周（如第14天和第28天）更换基质胶凝胶滴，因多次换液会逐渐使其松动。完整的基质胶凝胶滴对维持类器官的正常三维形态至关重要。按步骤17所述解冻所需量基质胶。按步骤26和27所述移除孔内培养基。轻柔移液10-15 µL 基质胶至每个BG-HFO培养皿。将培养板置于培养箱中1小时使基质胶固化。按步骤31所述向每个类器官添加预备好的培养基。收集BG-HFO进行整体免疫荧光染色和组织透明（15 min）。

49. 用无菌剪刀剪开p1000移液器吸头尖端以扩大开口（宽口吸头），设定150 µL体积，将培养板倾斜45°，对准BG-HFO进行吸取，随后转移至适宜的塑料容器中进行后续分析。

关键：若仅需部分BG-HFO用于下游分析而其余需维持培养，则必须在无菌条件下操作。若所有BG-HFO均用于下游分析，则无需无菌操作。

50. 免疫荧光：采用简短高效且经济实惠的整体免疫荧光协议时，请遵循步骤50A；若需处理大量样本以提升通量，请遵循步骤50B。

关键：转基因信号暴露于光照下会淬灭；因此若样本需进行PEGASOS透明化处理及转基因信号成像，第49步之后的所有操作均应在暗室中进行。

（A）整体免疫荧光染色（30 h）

(i) 按照步骤49所述，将所有相同实验条件和染色的BG-HFO转移至2 mL微量离心管中。

(ii) 用移液器轻柔移除培养基，用1.5 mL无磷酸盐缓冲液（PBS w/o）洗涤BG-HFO三次（通过添加并移除PBS w/o）。

(iii) （可选）去除Matrigel：弃去PBS w/o，加入1.5 mL冷（4℃）细胞回收液。将离心管置于4℃条件下以7转/分钟转速旋转40分钟。用冰冷PBS w/o洗涤两次。每次洗涤时使用宽口移液枪头轻柔上下吸取，彻底清除残留基质胶。完全去除基质胶后，BG-HFO将以均匀团块沉积于2 mL微量离心管底部，其间不存在透明基质胶培养基。

关键：强烈建议去除Matrigel以显著简化后续步骤中的试剂更换与手工操作。此外，去除基质胶可降低其自发荧光造成的背景噪声，从而改善成像效果。但需注意，结构复杂的类器官可能含有嵌入基质胶中的精细结构，此类情况建议跳过基质胶去除步骤。建议根据具体类器官的复杂程度优化此步骤操作。

(iv) 将每个BG-HFO转移至平底96孔板的单孔中。

(v) 用100 µL穿透固定缓冲液于室温避光条件下固定每个类器官1小时。

(vi) 用250 µL TBSX缓冲液每孔洗涤三次。

暂停点：经固定洗涤的BG-HFO可在4℃避光条件下保存1个月。但转基因信号会随荧光染料特性快速衰减，故建议用于PEGASOS透明化处理的样本保存时间不超过1周。

(vii) 室温下用100 µL封闭缓冲液封闭1小时。

(viii) 使用染色缓冲液将一抗稀释至所需浓度，将BG-HFO置于100 µL抗体混合液中于室温孵育20小时。

(ix) 每孔用250 µL TBSX洗涤四次。

(x) 避光操作：用含DAPI的SSB将二抗稀释至所需浓度，将BG-HFO置于100 µL抗体混合液中于室温孵育4小时。

关键：为防止二抗荧光团淬灭，后续所有步骤必须在避光条件下进行。

(xi) 用250 µL TBSX溶液洗涤每孔五次。

(xii) 采用落射荧光显微镜成像转基因荧光蛋白及抗体染色。

暂停点：类器官可在4℃避光条件下保存1周内进行成像或透明化处理。但建议尽快完成成像或透明化操作。

（B）高通量整标本免疫荧光染色（30 h）

(i) 按照步骤49和50A(i-iii)所述收集BG-HFO并去除基质胶。

(ii) 将相同培养条件/细胞系且染色相同的类器官转移至图5a所示对应塑料容器中，执行步骤50A(iv-xii)。通过观察内皮细胞（IC）/髓样细胞（ML）/神经节细胞（OL）的正确分化模式来检测BG-HFO方案的成功性，可采用HES3 NKX2.5-eGFP细胞系进行监测；若使用其他非心肌细胞报告细胞系，则需通过高通量染色方案评估NKX2.5阳性分化的正确性。

关键：整个操作过程中必须确保BG-HFO细胞不相互粘连或紧密相邻（强烈建议采用振荡操作以避免持续紧密接触），否则将阻碍试剂扩散。因此在静态孵育时，建议使用p200吸头轻柔分离已粘连的BG-HFO细胞。

51. 组织透明化处理：免疫荧光染色（步骤50）后，需进行组织透明化处理以实施激光显微镜观察。若需进行基于MSBB的透明化处理（抑制转基因信号），请遵循步骤51A；若需进行PEGASOS透明化处理（保持转基因信号），请遵循步骤51B。若需对未染色的BG-HFOs直接进行PEGASOS处理（接续步骤49），请遵循步骤51C。

关键：后续所有操作须在暗室进行，以防止荧光团（二抗或转基因信号）褪色。

关键：组织透明化需较大体积样本；因此自本步骤起，将BG-HFO转移至更大塑料容器。

关键：透明化成功后，样本在相应透明化介质（MSBB/BB-PEG）中呈现完全透明状态。因此，无论是否需要DAPI作为核染色剂，都必须对所有样本进行DAPI染色，以便在紫外光下观察，并可操作至观察室进行显微分析（如步骤52-58所述）。

（A）基于MSBB的透明（转基因信号淬灭）（包括整体染色[步骤50或51]：54小时）

关键：所有操作均在室温下进行，使用7 rpm转速的管式振荡器旋转以抑制BG-HFO聚集。

(i) 将BG-HFO转移至对应大的塑料容器。

(ii) 置于50%乙醇（体积比）稀释液（用蒸馏水稀释）中孵育2小时。

(iii) 更换为75%乙醇（体积比）稀释液（用蒸馏水稀释）并孵育1小时。

(iv) 弃去75%乙醇溶液，每份样品用1 mL 99%乙醇冲洗。

(v) 置于新鲜99%乙醇中过夜孵育。

(vi) 用2毫升MSBB冲洗样品。

关键：注意加入MSBB后样品会浮起并迅速透明化，导致观察困难。因此建议使用紫外手电筒。为避免吸入样本，操作时需按压移液器活塞至第一档位，并将吸头置于塑料容器底部。小心吸取MSBB溶液。注意样本可能粘附于吸头。

(vii) 需在新鲜MSBB中孵育至少6小时。当BG-HFO肉眼不可见时，透明化程序即告完成。

暂停点：经透明化的BG-HFO可在MSBB中于室温保存长达1周。

（B）PEGASOS 显色（多重显色，保留转基因信号）（包括整体染色[步骤50或51]：58小时）

关键：为确保试剂充分渗透，步骤51b的所有孵育步骤均在37℃条件下进行，使用70 rpm转速的轨道振荡器进行振荡。

(i) 30% DLS孵育2小时。

(ii) 移除30% DLS，50% DLS孵育3小时。

(iii) 移除50% DLS，70% DLS孵育3小时。

(iv) 用2 mL tb-PEG洗涤。

(v) 在新鲜tb-PEG中过夜孵育。

(vi) 弃去tb-PEG，用2 mL BB-PEG洗涤。

关键：需注意样品加入BB-PEG后会浮起并迅速变透明，导致观察困难。因此建议使用紫外手电筒。为避免误吸样品，操作时需将移液器活塞推至第一档位，并将吸头置于塑料容器底部。小心吸取BB-PEG。注意样品可能粘附于吸头。

(vii) 移除BB-PEG，置于新鲜BB-PEG中孵育12小时。

(viii) 移出37℃环境，室温保存。

暂停点：经澄清处理的BG-HFO可在BB-PEG中于室温保存长达1周。

（C）PEGASOS透明处理（转基因信号保留）（31 h）

(i) 将BG-HFO以每管100 µL体积置于SSB缓液中，于室温下以7 rpm转速旋转孵育1小时。

(ii) 用TBSX缓液洗涤三次.

(iii) 继续执行PEGASOS透明程序（自步骤51B(i)起）

激光显微镜样品安装（每个样品1 min）

注意：经成功清除后，BG-HFO将完全透明化。通过DAPI染色并使用紫外手电筒，可实现其可视化操作，并转移至观察室进行显微分析。

52. 将紫外手电筒置于通风橱内，确保光束远离操作者，并能轻松照射塑料容器底部。

注意：紫外线具有危险性，可导致皮肤灼伤和DNA损伤；因此操作时务必将手电筒远离身体，并佩戴手套、实验服及面部防护装备以避免皮肤接触。

53. 将微型离心机/锥形管直立放置，等待BG-HFO完全沉降至管底。

54. 在紫外光照射下观察管底，观察DAPI染色的BG-HFO。

55. 移除所有MSBB/BB-PEG，管内保留约1 mL。

56. 使用宽口p1000吸头吸取单个BG-HFO。

57. 将吸取的BG-HFO置于ibidi微观载玻片18孔观察室上方。使用紫外手电筒观察吸头内的BG-HFO，将其注入单个孔中。每个孔最多可成像两个BG-HFO。

注意：MSBB和BB-PEG均含危险化学物质，吸入或接触皮肤、眼睛会引起刺激。因此必须清除观察室孔外残留的MSBB/BB-PEG。运输至显微镜前，可用浸有乙醇的纸巾擦拭观察室边缘的残留物。

58. 盖上观察室盖板以封存气体，随后进行显微分析。

生物材料

试剂

设备

试剂制备

参考文献：Dardano M, Wilson L, Zweigerdt R, Drakhlis L. Production of human blood-generating heart-forming organoids and sample preparation for advanced imaging. Nat Protoc. 2025 Oct 30. doi: 10.1038/s41596-025-01268-zIF: 16.0 Q1 .

来源：类器官学社