STAR Protocols：肝祖细胞类器官构建及肠癌-肝细胞互作模拟方法
细胞竞争是一种质量控制机制，能够促进相对于更健康细胞的次优细胞被清除。癌细胞利用这些机制进行扩张，但其背后的分子通路仍不明确。荷兰Saskia Suijkerbuijk团队提出了一种无基质微组织的生成方案，通过显微镜或转录组学/蛋白质组学技术，重现肠癌细胞与肝细胞样细胞之间的相互作用。文献描述了生成和分化肝脏祖细胞类器官以及微组织形成的步骤，并详细介绍了免疫荧光染色、微组织固定和细胞分选的实验流程。
文章介绍
· 题目：Protocol for generating liver metastasis microtissues to decipher cellular interactions between metastatic intestinal cancer and liver tissue
· 期刊：STAR Protocols
· 影响因子：1.3
· 发表日期：2025年1月
#1
研究背景
Background
细胞竞争作为一种细胞间的质量控制机制，通过清除低适应性细胞来维持组织完整性。最近的研究发现，细胞竞争在肠癌肝转移中起着关键作用。本研究利用一种新型微组织模型，概述了转移性肠癌细胞在转移部位利用健康肝细胞作为支架进行扩张的逐步过程。那么如何利用微组织模型揭示细胞间相互作用对转移性生长的影响？
#2
研究思路
Methods
肝脏祖细胞类器官分化
标记细胞群
两个细胞群混合形成微组织
细胞分选
#3
研究设计
Research design
工作流程包括肝祖细胞类器官的产生和传代（步骤1-27）、肝祖细胞类器官的分化（步骤28-33）、微组织的生成（步骤34-48）、微组织的免疫荧光染色和封片（步骤49-70）、从混合微组织中分选细胞（步骤71-88）。
#4
预期结果
Results
利用混合微组织研究肠道癌细胞与肝细胞样细胞之间的竞争性相互作用，尤其是在肝脏转移中的作用。通过明场显微镜监测肝细胞样类器官的分化状态，并测量特定标志基因（如Albumin、Cyp3A和Krt19）的表达来评估肝脏类器官的分化。研究发现，癌细胞在野生型肝细胞中表现出增殖优势，后者为癌细胞提供转移生长的支架。进一步的免疫荧光染色表明，癌细胞与野生型细胞之间的相互作用会导致野生型细胞的死亡，尤其是在接触界面处。
混合微组织与类器官和拼接体相关，但更为简化，只包含来源相似的细胞类型，并在无基质环境中培养。该模型有助于研究肝脏转移中的分子机制。通过组学方法（如RNA测序）可深入理解特定通路在细胞竞争中的作用。该模型还可以用于药物筛选，并可扩展应用到其他类型的肝脏转移性癌症。
局限性
该研究使用两种小鼠成体干细胞衍生的类器官，专门研究肝脏转移中肝脏和肠癌上皮细胞之间的竞争性相互作用。由于微组织仅由上皮细胞组成，因此排除了其他细胞成分的干扰，适合研究上皮细胞间的竞争，但不适合模拟含有高密度基质和免疫细胞的转移生长模式。为了评估竞争效应，研究者进行固定和成像分析，并计划使用时间延迟显微镜观察细胞动态互动。由于微组织是自由漂浮的，长时间成像困难，需要通过琼脂糖或甲基纤维素等材料固定微组织，优化这一过程以便进行长时间观察。潜在的解决方案是将微组织空间限制或嵌入低浓度的琼脂糖或甲基纤维素中，这种技术已经成功地用于对斑马鱼胚胎进行为期三天的活体成像。
准备工作（1天）
1. 在冰上或4℃（8-16 h）解冻BME2.
2. 确保有用于类器官培养的12孔未经处理的聚苯乙烯板和用于微组织形成的圆形（U形底）板。
3. 准备缓冲液和介质。
4. 准备玻璃巴斯德移液管。
5. 将离心机预冷至4℃。
注：为了成功形成微组织，必须使用具有很强抗粘附性能的圆形U形底板。
实验步骤
肝祖细胞类器官的产生和传代：3-4天
1. 准备消化液并预热至37℃。
2. 将新鲜分离的小鼠肝组织放入100 mm培养皿中，将组织切碎成小块
3. 将切碎的组织转移到装有10 mL冰冷基础培养基的50 mL试管中，让组织块沉淀。
4. 丢弃含有脂肪和红细胞等碎片的上清液（±7.5 mL）并重复洗涤一次。
5. 去除剩余的洗涤培养基，加入约10 mL的消化液。
6. 将消化混合物在摇床上于37℃孵育45 min。
7. 检查等分溶液中是否存在清晰的导管结构，如果不存在，则更换消化溶液，并将其放回37℃的振动器中。
8. 每20-30 min进行一次检查，直到出现干净清晰的导管。
9. 将上清液转移至15 mL试管中，加入冰冷的基础培养基至15 mL。
10. 在4℃下以300 g的转速离心5 min，使材料沉淀。
11. 重复洗涤一次。
12. 通过手工挑选导管结构进行富集。
13. 小心倒置平板，在37℃和5%CO2下培养15-30 min，使BME2固化。
14. 每孔轻轻加入750 μL室温（18℃-25℃）扩增培养基。
15. 在37℃和5%CO2下培养。
16. 每3-4天传代一次类器官。
注：类器官很脆弱，在传代过程中将它们保持在低温下有助于保持其功能完整性和活力。
17. 使用冰冷的基础培养基，用p1000移液管上下移液的同时刮取孔底，收获类器官。确保所有BME2液滴都已脱落和破碎。
18. 将类器官悬浮液收集在15 mL离心管中并保持在冰上。
19. 在4℃下以300 g离心3 min。形成三个透明层：培养基、BME2和类器官（图1）。
图1 肝脏祖细胞类器官在破裂和接种分化之前。培养基（上）、BME2（中）和类器官沉淀（下）。
20. 小心去除培养基和BME2层，不要破坏类器官沉淀。
21. 将沉淀重悬于1 mL冰冷的Basic培养基中。
22. 使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管机械破坏类器官。上下移液10-20次，同时将移液管尖端压在试管底部，直到形成小碎片（图2）。
图2 生成肝祖细胞类器官的小片段。机械破坏的肝脏原代器官组织的明视野示例，这些组织需要进一步破坏（左图，箭头所示），具有后续播种和分化的最佳大小（中图，星号所示），以及破坏过度（右图，箭头所示）。
注：使用前，将玻璃巴斯德移液管短暂地穿过火焰，对玻璃巴斯德移液管进行消毒。用基础培养基预润湿移液管，一次只吸出少量，以避免类器官附着在玻璃表面。
23. 在4℃下以300 xg的速度离心3 min。
24. 小心吸出上清液，并以2:1的比例将沉淀重悬于BME2和基础培养基中。
25. 在12孔悬浮板中以10-12 μL液滴均匀分配BME2/类器官混合物。
26. 小心倒置平板，在37℃和5%CO2下培养15-30 min，使BME2固化。
27. 每孔轻轻加入750 μL室温（18℃-25℃）扩增培养基。
肝祖细胞类器官的分化：15天
28. 按照方案的步骤17-27传代肝祖细胞类器官。
29. 铺板并添加扩增培养基后（步骤27），在37℃和5% CO2下孵育5天，第3天补充培养基。
30. 第5天，将肝脏类器官培养物切换为完整的HepatiCult类器官分化培养基（ODM）。
31. 第8天和第11天，每孔加入750 μL新鲜的完全HepatiCult ODM。
· 关键：类器官的破碎至关重要。建议每移液5-10次后使用光学显微镜监测进展情况。在类器官变成单细胞之前停止破碎。
32. 在第14天，使用新鲜的完整HepatiCult ODM培养基，并补充Noggin，以保持肝脏和癌症类器官培养物在最佳条件下生长。
· 关键：确定最佳培养基条件以将类器官培养物维持在功能性和潜在的完全分化状态至关重要。当将分化的肝脏细胞与其他细胞群体混合时，建议进行培养基筛选，以确定最适合两种细胞群体的培养条件。例如，本方案中添加Noggin以支持Apc-/-KrasG12D/WTTrp53-/R172H肠癌类器官。
33. 第15天，在添加了Noggin的完全HepatiCult ODM培养液中分化的肝脏和癌症类器官就可以用于生成微组织了（图3）。
图3 肝祖细胞类器官15天分化概述。
注：建议通过每2-3天采集一次图像来监测肝类器官在15天分化期间的进展。
微组织的生成：3天
34. 按照方案的步骤17-20收获肝细胞样和癌症类器官。
35. 去除培养基和BME2层（步骤20）后，向沉淀中加入5 mL冰冷的基础培养基，并使用10 mL 血清重悬。
36. 在4℃下以300 g离心3 min。BME2层显著减少（图4）。
图4 制备用于微组织生成的肝细胞样类器官第三步洗涤后,培养基（上）BME2（中）和类器官沉淀（下）。
37. 重复步骤35和36两次。
· 关键：为了成功生成微组织，请确保试管中没有BME2残留物，然后再进行下一步将类器官分解成碎片
38. 小心去除上清液，不要破坏类器官沉淀。
39. 将沉淀重悬于1 mL冰冷的基础培养基中。
40. 使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管分别机械破坏癌症和肝细胞样类器官。
注：对于肝脏类器官，轻轻上下移液5-10次，直至形成中等大小的碎片。随后，用移液器吸头按压试管底部，用力将癌细胞组织破碎成更小的碎片（图5）。
图5 生成肝细胞样和癌症类器官片段用于微组织形成。
· 关键：避免将肝细胞样细胞破碎成非常小的片段或单个细胞，因为这会诱导损伤反应并损害细胞的分化状态。每5-10次移液后使用光学显微镜监测进度。
41. 在4℃下以300 g离心3 min
42. 为每种条件准备一个Eppendorf管，并根据所需的混合比例加入相应体积的每种细胞群体，以生成微组织。
43. 在4℃下以300 g离心3 min。
44. 小心弃去上清液，加入约20-25 μL补充有Noggin的HepatiCult ODM。
45. 将Eppendorf管在37℃下避光孵育30 min，以促进细胞聚集和微组织形成。
· 关键：孵育前小体积重悬沉淀对于高效细胞聚集和混合微组织的形成非常重要。
46. 培养后，为每个所需的微组织再添加100 μL HepatiCult ODM（添加 Noggin）到聚集体中。
47. 小心重悬聚集体悬液，并将每孔100 μL分配到96孔U形底板中，以形成每孔一个微组织。
48. 在37℃和5% CO2条件下培养至少3天，以促进微组织的形成。经过此阶段后，微组织可以按照以下章节所述进行进一步分析。
注：建议使用光学显微镜确认聚集体的均匀分布，并每天使用光学显微镜监测微组织形成的进展（图6）。
图6 微组织的聚集和形成。
· 关键：在第3天将它们重新悬浮在培养基中，确保成功生成微组织。如果它们保持完整，就可以使用了。生成的微组织的质量取决于肝细胞样细胞能否维持在分化状态。这可以通过测量分化标记物的表达水平（图7A-C）或进行免疫染色以检测祖细胞标记物的缺失（图7D）来评估。
注：使用前述步骤中描述的足够质量的输入材料（例如，分化良好的类肝细胞、维持良好的可存活癌细胞和最佳密度）时，微组织形成的成功率为90-95%。生成的微组织大小取决于来源细胞类型，纯癌症微组织约为±0.4 mm²，混合微组织约为±4.5 mm²（见图7E）。
图7 输入材料和微组织的质量控制。（A–C）肝细胞标志基因Albumin（A）和Cyp3a（B）以及肝脏祖细胞标志基因Krt19（C）的蛋白水平。（D）纯微组织的代表性3D重建拼接共聚焦图像，显示SOX9染色（灰色）。（E）纯微组织和混合微组织的表面积定量。
微组织的免疫荧光染色和封片：3-4天
49. 固定微组织时，小心移去50 μL培养基，在每个含微组织的孔中剩余的50 μL培养基中加入50 μL固定液。
50. 在18℃-25℃下避光孵育30-35 min。
· 关键：培养时间结束时，小心吸出一点培养基并移动孔中的微组织，确认固定成功和微组织完整。结构应连贯完整。丢弃破损或中断的微组织。
51. 去除固定液，用100 μL PBS0 洗涤两次。
· 关键：固定后，微组织可以在PBS0中避光保存2-3周，然后继续进行染色方案。
52. 小心吸出PBS0，然后加入75 μL封闭液，并在避光的情况下在4℃下孵育8-16 h，以封闭和透化微组织。
53. 去除封闭溶液，加入75 μL用封闭溶液稀释的所需一抗。避光并在4°C下孵育12-16 h。
54. 用150 μL洗涤液在18-25℃下洗涤3次，每次至少5 min，这些步骤可以延长。
55. 加入75 μL在封闭溶液中稀释的适当二抗。避光并在4℃下孵育12-16 h.
· 关键：封闭/透化以及一抗和/或二抗孵育步骤均可在4℃避光保存的情况下延长2-3 天。
注：在第二抗体孵育期间（步骤55）可加入染料溶液，如DAPI或类黄素。
· 关键：为避免串扰，应通过排除光谱与微组织中已经表达的荧光团重叠来选择二抗和染料。
56. 用150 μL洗涤缓冲液在18-25℃下洗涤两次，每次5 min。
57. 在最后一个洗涤步骤后加入150 μL PBS0。
· 关键：在所有洗涤步骤中，请非常小心地更换液体，并确保不会意外吸出微组织。
注：此步骤后，染色的微组织可以在4℃下避光长期储存。为避免信号丢失，建议在一周内进行成像。添加PBS0并用封口膜密封板，以防止微组织变干。
58. 要将微组织安装在显微镜载玻片（25×65 mm）上，请使用Kimwipes标记载玻片并清洁载玻片表面。
59. 使用薄型（0.05 mm）粘合剂双面垫片（iSpacers，图 8A）在载玻片上为每个待安装的微组织创建限位：
a. 从iSpacer上切下所需数量的密封圈（图8B）。
b. 剥去iSpacer一侧的保护衬垫（图8C）。
c. 小心取下圆形孔插件（图8D）。
d. 垂直于载玻片，在干燥的载玻片表面连续贴上3-4对iSpacers，确保有粘性的一面粘在载玻片上（图8E）。
e. 轻轻按压，将垫片密封在载玻片上。
f. 小心地从iSpacers上取下第二层保护膜（图8F）。
图8 用于成像分析的安装微组织步骤。（A-D）从一侧撕下保护衬垫，并从一对iSpacer中取出圆形孔插入物；（E-G）将一对iSpacer垂直粘贴到载玻片上，并撕下第二层保护衬垫；（H、I）展示用于微组织形成的U形底96孔板；（J-L）将微组织重悬于RapiClear溶液中，并使用预切的P200枪头将其转移至iSpacer限制区域；（M-P）在iSpacer上盖上盖玻片，用指甲油密封盖玻片边缘，并标记微组织以便在成像时轻松识别。
· 关键：验证iSpacer是否完全粘附在载玻片上。
60. 吸出PBS0并使用预先切割的P200移液器吸头向每个含微组织的孔中加入15 μL的RapiClear透明溶液（图8J）。
61. 使用相同的预切P200移液器吸头，将悬浮在15 μL RapiClear清液中的每个微组织立即转移到单独的iSpacer封闭容器中（图8K）。
62. 使用新的无切口P200移液器吸头，在每个微组织顶部多滴一滴RapiClear清 洗液，并将其置于封闭装置的中心位置（图8L）。
63. 对所有要封片的微组织快速重复步骤60-62。
64. 在iSpacers上放置盖玻片（24×50 mm，厚度1.5号），以密封含有微组织的密闭空间（图8M）。
65. 轻轻按压盖玻片的边缘，以确保正确密封孔。
66. 使用Kimwipes小心地从盖玻片上去除任何多余的溶液。
67. 在盖玻片的边缘涂抹透明指甲油以密封并确保其保持固定（图8O）。
68. 在显微镜载玻片侧圈出每个微组织的位置，以方便成像过程中的样品检测（图8P）。
· 关键：在加入RapiClear（步骤60）后迅速安装，因为溶液会清除微组织，而微组织的透明度会影响微组织的定位（步骤62）和标记（步骤68）。
注：此步骤后，封固的微组织玻片可以在4℃的避光盒中储存2-3天。
69. 使用所选平台对微观组织进行成像。建议使用基于共焦的平台，使用高NA 20x-25x Dry物镜。
70. 获取Z轴堆叠图像，并使用拼接技术捕捉整个微组织（图9）。
图9 微组织中细胞相互作用的成像。(A-C）纯Wild-Type（A）、混合（B）和纯癌（C）微组织的代表性三维重建拼接共聚焦图像。(D、E）对照组（D）和Z-VAD-FMK处理过的混合微组织染色为裂解的caspase-3（灰色）的具有代表性的三维重建拼接共焦图像。
从混合微组织中分选细胞：1天
71. 使用预切的P200移液器吸头将4-5个微组织转移到含有1 mL冰冷基础培养基的15 mL试管中。
72. 在4℃下以300 g 离心 3 min。
73. 小心吸出上清液。
74. 向微组织沉淀中加入 1 mL解离溶液。
注：使用 P200 移液器吸头将微组织破碎成更小的碎片，然后使用火焰抛光玻璃巴斯德移液管将其通过移液管10-15 次进行机械破坏。
75. 在37℃下孵育 2 min。
76. 使用相同的巴斯德移液管进一步破坏，直到小细胞片段没有细胞外基质。
77. 用9 mL冰冷的Basic培养基稀释混合物，灭活酶活性。将试管放在冰上。
注：Dispase II和Collagenase A的蛋白酶活性促进了细胞与细胞外基质的分离，从而生成小型细胞集群，同时保持细胞的完整性和活力。
78. 在4℃下以300 g 离心 3 min。
79. 小心吸出上清液，不要破坏细胞沉淀。
80. 向沉淀中加入1 mL预热至37℃的TrypLE，并使用火抛光玻璃巴斯德上下吹打10次，彻底重悬。
81. 在37℃下孵育1 min。
82. 继续移液，直至形成单细胞。
· 关键：在与解离溶液或TrypLE孵育过程中，必须在孵育期间轻轻重悬细胞一次或两次，以避免细胞聚集。
注：对于将微组织解离为单个细胞，推荐使用TrypLE。与其他解离试剂不同，TrypLE通过稀释而不是胰蛋白酶抑制剂来失活。当使用其他解离试剂时，请参考供应商的指南获取详细说明。
83. 用 9 mL 冰冷的基础培养基稀释TrypLE，使其失活，并保持在冰上。
84. 在4℃下以300 g 离心 3 min。
85. 小心吸出上清液，不要破坏细胞团，并将其置于冰上。
86. 用100 μL冰冷的FACS缓冲液预湿5 mL圆底聚苯乙烯管的细胞过滤器盖。
87. 加入250 μL冰冷的FACS缓冲液，并将单细胞沉淀通过35 μm细胞过滤器。
88. 将细胞放在冰上，然后立即使用所选平台进行分选（图10）。
图10 使用细胞分选分析微组织中的细胞相互作用。
注：在分选之前，建议使用稀释后的活/死染料（例如DAPI、噻唑红）来鉴定并分选目标群体的可存活细胞。通常，从一个微组织中可回收的可存活单个细胞数量约为500-2000个。
故障排除
❓问题1：在步骤32，用于分化肝脏前体类器官的完整HepatiCult ODM可能不支持其他类器官系的最佳生长，而这些类器官系是用于生成不同混合微组织的。
✔可能的解决方案：为了优化混合微组织的生长，首先通过使用完整的HepatiCult ODM进行培养基筛选，调整培养条件以支持不同细胞群体的分化和生长。例如，在生成肝细胞样细胞与癌细胞的混合微组织时，添加Noggin有助于癌症类器官的生长。如果该方法无效，可考虑使用Broutier等人提出的肝脏分化培养基，并根据需要调整成分。通过实验，发现去除DAPT和地塞米松的Apc微组织培养基能够支持Apc−/−小肠类器官生长，同时也维持了肝细胞样细胞的存活。
❓问题2：在步骤28-33，分化类器官附着在板的底部。
✔可能的解决方案：使用未包被的多孔板进行分化方案的悬浮培养，并防止培养物过度拥挤。
❓问题3：在步骤40，将肝细胞样细胞切割成非常小的碎片或单个细胞可以诱导损伤反应，并伴随转分化为祖细胞状态。
✔可能的解决方案：通过温和的操作打散肝细胞样类器官，以防止过度解离。通过使用光学显微镜频繁监测过程（每进行2-3次吸排），观察它们的形态，直到达到所需的大小（图5）。
❓问题4：在步骤35-37去除基质过程中，细胞沉淀物的体积减小。
✔可能的解决方案：为了防止沉淀物被破坏，使用P1000移液管而不是基于真空的吸取系统来吸取培养基和基质。当沉淀物意外被破坏时，不要丢弃培养基，而是保留培养基并重新离心后继续操作。
❓问题 5：在步骤57，免疫荧光染色程序后，孔内为空。
✔可能的解决方案：微组织在洗涤过程中容易被吸走。因此，在移除液体时，务必使用P200移液管小心操作，避免接触微组织。频繁检查培养板，确保每个孔内都有微组织。
❓问题 6：在步骤61，将微组织转移到显微镜载玻片时，微组织粘附在预切的P200移液管尖端上。
✔可能的解决方案：使用预切的P200移液管吸取少量PBS0，并尝试将悬浮的微组织释放到U型底孔中，再次进行显微镜载玻片的安装。
❓问题 7：在步骤69和70，安装的微组织在显微镜观察过程中干燥，荧光信号随时间丧失。
✔可能的解决方案：确保iSpacer的粘性面完全贴合显微镜载玻片，通过轻轻按压，直到iSpacer与玻璃载玻片之间不再有气泡（步骤59）。确保载玻片的所有边缘都用指甲油完全密封（步骤67）。如果仍有气泡存在，应立即拍摄显微镜图像，以防信号丧失（步骤69）。
❓问题8：在成像过程中，对透明化微组织样本的导航较为困难（步骤69）。
✔可能的解决方案：确保在添加RapiClear溶液后迅速安装微组织，因为这样可以增强其透明度（步骤60和61）。此外，将微组织放置在iSpacer限制区的中心并标记其位置（步骤62和68，图9）。
❓问题9：在细胞解离过程中形成细胞团并导致细胞活力下降（步骤74、76、80和82）。
✔可能的解决方案：在与解离液或TrypLE孵育过程中，避免过长时间的孵育和微组织重悬不足。为了避免细胞活力丧失，可以通过轻轻旋转玻璃巴斯德移液管手动去除细胞碎片。或者在孵育混合物中添加DNase，通过降解裂解细胞释放的DNA来防止团块的形成。
材料和设备
参考文献
Lamprou M, Krotenberg Garcia A, Suijkerbuijk SJE. Protocol for generating liver metastasis microtissues to decipher cellular interactions between metastatic intestinal cancer and liver tissue. STAR Protoc. Published online January 20, 2025. doi:10.1016/j.xpro.2024.103575
来源：类器官学社
